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2型糖尿病大鼠心肌PI3K/Akt/mTOR信号通路的改变及
作者:中糖院 时间:2020-12-27 13:18:09 浏览:81

近年来,糖尿病(diabetes mellitus,DM)患病率急剧上升,已成为影响人类身体健康的主要疾病之一。糖尿病若未能得到及时诊断和正规治疗,可引起多种慢性并发症。其中,糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是DM心血管并发症中一种独立、特异的心肌病,与糖尿病患者发生心力衰竭和死亡率升高密切相关,是DM患者死亡的主要原因[]。

研究表明,PI3K/Akt/mTOR信号通路调节多种细胞的生命活动,包括细胞的生长、增殖和分化,其过度激活参与糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、认知功能障碍和胰岛素抵抗等[]。此外,Sirt1作为体内关键的生物信号调节因子,广泛参与多种信号通路的激活与抑制调控,已被广泛研究。有研究表明[],Sirtl失活条件下,PI3K/Akt/mTOR通路激活,进而诱发动脉粥样硬化发生。而在2型DCM中,Sirt1对该信号通路的调控作用尚未明确。本文通过检测Sirtl及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白在DM大鼠心肌及高糖培养的H9C2细胞中的表达变化,并将白藜芦醇和尼克酰胺——Sirt1的特异性激动剂及抑制剂作用于高糖培养的H9C2细胞中,探讨Sirtl对该信号通路的调控作用,为糖尿病心肌病的治疗提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 实验动物及模型建立

体质量200~220 g的♂健康SD大鼠40只,购自山东鲁抗医药股份有限公司实验动物中心。适应性喂养1周后,采用高脂饮食(猪油30%,胆固醇2.5%,脱氧胆酸钠1%, 常规饲料66.5%)随机对30只大鼠灌胃,设为糖尿病模型组(DM组),另设正常对照组(Control组)10只,并于5周末禁食12 h后,DM组大鼠一次性腹腔注射1%链脲菌素(30 mg·kg-1,pH=4.5柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液),Control组大鼠注射同体积柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液。72 h后尾静脉采血,血糖试纸检测空腹血糖值(fasting blood glucose,FBG)。DM组造模成功大鼠随机分为2周模型组、4周模型组和8周模型组,继续高脂饮食灌胃,Control组继续以普通饲料喂养8周。

1.2 细胞及模型建立

大鼠心肌细胞株H9C2,由美国标准菌种收藏所提供。将对数生长期细胞分为正常对照组、DMSO组(78.12 mmol·L-1)、高糖(HG)组(33 mmol·L-1)、白藜芦醇(Res)组(20 μmol·L-1)、尼克酰胺(Nam)组(40 mmol·L-1),作用24 h。

1.3 材料与试剂

链脲菌素、戊巴比妥钠(美国Sigma公司);血糖试纸(强生中国医疗器材有限公司);SABC免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物技术有限公司);辣根酶标记山羊抗兔(北京中杉金桥生物技术有限公司);TRIzol(上海东洋纺生物科技有限公司);RIPA裂解液、Western转膜液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒和SDS-PAGE电泳液均购自碧云天生物技术研究所;PVDF膜(0.45 μm,美国SERVA公司);所用单克隆抗体为:Sirt1(美国Novus公司),PI3K、Akt、mTOR(美国Cell Signaling Technology公司),S6K1(美国Abcam公司)。

1.4 大鼠空腹血糖检测

DM组大鼠分别于2、4和8周末禁食12 h,颈静脉窦取血,离心分离血清,检测FBG及胰岛素(fasting insulin,FINS)水平,计算胰岛素敏感指数(insulin sensitive index,ISI),公式为ISI=ln[1/(FINS×FBG)]。

1.5 大鼠超声心动图

大鼠分别于造模2、4、8周末,禁食12 h,戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,并固定于手术台上,使用小动物超声成像系统Vevo 2100(维胜中国)检测左心室舒张末期内径(left ventricular internal diastolic diameter,LVIDd)、左心室收缩末期内径(left ventricular internal diameter at end-systole,LVIDs)、左室舒张末期室壁厚度(left ventricular posterior wall thickness in diastole,LVPWd)、左室收缩末期室壁厚度(left ventricular posterior wall thickness in systole,LVPWs)、短轴缩短率(fractional shortening,FS)、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)及左心室质量(left ventricular mass,LV Mass)。

1.6 大鼠心肌标本收集

大鼠麻醉后迅速取出心脏,用预冷生理盐水洗净并用滤纸吸干,剔除血管、脂肪等非心肌组织,分别称取心脏重量(heart weight,HW)和左心室(含室间隔)重量(LV Mass),并计算心脏(左心)指数=心脏(左心室)重量(mg)/体重(g),置于-80℃中保存待用。

1.7 Western blot实验

提取蛋白,BCA法测定各组总蛋白浓度,于SDS-PAGE凝胶电泳进行分离。冰浴下湿法转膜2h后,用体积分数为5%的脱脂奶粉封闭1 h,一抗4℃孵育过夜。次日与辣根过氧化物标记的二抗共孵育,用增强型化学发光试剂进行显色,并利用灰度分析软件定量分析。

1.8 qRT-PCR

将细胞用胰蛋白酶消化,1 000 r·min-1,离心5 min收集细胞。按TRIzol提取程序(说明书)提取细胞总RNA,按AWV逆转录试剂盒操作说明进行逆转录后,4℃保存。各目的基因的扩增引物序列如所示,扩增条件:94℃预变性3 min,然后94℃变性30 s,55℃变性30 s,72℃延伸60 s,共35个循环,最后72℃延伸5 min,快速冷却至4℃保存。2%琼脂糖凝胶电泳后,凝胶成像仪观察。用BandScan5.0软件测定条带灰度值,进行统计学分析。

Table 1 PCR primer used in experiment